SS31菌肥对玫瑰香葡萄土壤微生物代谢及 [复制链接]

摘要：菌肥作为新型肥料在现代栽培中广泛应用，但其应用效果受微生物种类、寄主植物、土壤环境等因素制约。本研究采用Biolog-ECO方法明确SS31菌肥处理后土壤微生物群落代谢特征，并结合荧光数据解释SS31菌肥提高葡萄叶片光合性能的机制和有效性，研究结果将为SS31菌肥在葡萄上的推广应用提供科学依据。以“玫瑰香”葡萄幼苗为试材，设计6个浓度SS31菌肥处理，测定土壤微生物代谢活性、多样性指数、对31种营养物质的利用率、叶片叶绿素荧光参数等指标的变化。SS31菌肥处理不同程度提高了土壤平均颜色变化率(AWCD)、Shannon指数、Simpson指数和McIntosh指数。其中，T2处理在提高土壤微生物群落代谢活性、丰富度、优势种群的地位和多样性方面效果较好。菌肥处理促进了土壤微生物对碳水化合物、羧酸、氨基酸和胺类的利用，增强了土壤微生物对β-甲基-D-葡萄糖苷、D-木糖、D-甘露醇等单一营养物质的代谢活性。适宜浓度菌肥处理能够提高叶片SPAD、最大光化学效率（Fv/Fm）和光合性能指数（PIABS）。其中，T2处理显著提高了单位面积有活性反应中心的数量（RC/CSO）和单位反应中心用于电子传递的能量（ETO/RC），明显降低了单位反应中心耗散的能量(DIo/RC),最终诱导叶片光能利用潜力的增强。综上，SS31菌肥处理能够有效增强玫瑰香葡萄根域土壤微生物群落代谢活性和多样性。其中，T2处理效果最好，提高了土壤微生物对碳水化合物和羧酸的利用以及葡萄叶片的光合性能。

从19世纪初期过磷酸钙等化肥出现，为了增加农作物的产量人类开始使用化肥辅助农作物生产，但过量使用化肥造成了肥力下降、土壤环境恶化、农作物品质降低、温室气体排放和水污染等负面影响。近年来，为了缓解化肥带来的负面效应，人类逐渐走上了寻找化肥替代品的道路。菌肥作为有机和可持续农业中的新型肥料成为多年来肥料研究的焦点。一些研究发现，菌肥能够增加土壤有机碳含量、土壤酶活性，提高肥料利用率，促进作物生长，影响土壤中微生物群落结构和功能多样性。土壤微生物是一类多样性和物种丰富度极高的生物类群，驱动土壤中大部分物质的转化，其结构和组成的改变直接影响土壤生态系统的结构和功能。研究指出，土壤微生物种群数量及功能多样性受土壤理化性质、气候等因素的驱动。同时，施肥等人类活动通过对土壤理化性质的扰动也会直接影响着土壤微生物群落结构。且研究指出，菌肥的应用效果受载体、微生物种类、寄主植物、土壤环境等影响而产生差异，因此应根据每种植物的需求和环境，确定其天然微生物组，并为其设计菌肥。

SS31菌种(Streptomycessaraceticus31)由台湾中兴大学植物病理学系分离，属于生防及促生菌种。基于SS31发酵而成的菌肥已在部分农作物上应用，具有促进根系生长、提高产量及品质的功效。然而，关于SS31菌肥对根域土壤微生物群落代谢特征和荧光特性的影响鲜见报道。鉴于菌肥在物种上应用存在差异，本研究以“玫瑰香”葡萄为试材，研究SS31菌肥对葡萄根域土壤微生物功能多样性、对31种营养物质(含碳源和氮源)的利用情况、光系统2(PSII)功能以及植株生长发育的影响，明确SS31菌肥对葡萄叶片光合电子传递的调节效应，揭示SS31菌肥调控葡萄根域土壤微生物群落代谢的方向，试验结果将为SS31菌肥在葡萄上的推广应用提供理论依据。

一、材料与方法

1.1材料与处理

试验在天津农科院现代农业科技创新基地进行。以当年生“玫瑰香”葡萄扦插苗为试材，年5月将苗木定植于26cm×21cm的黑色塑料营养钵内，常规管理，及时去除杂草和凋落物等。为保证定植用栽培园土能够真实准确反映玫瑰香葡萄根域土壤微生物代谢特征，这部分土壤取自园区内连续栽培玫瑰香葡萄3年的地块，首先清除该地块凋落物，然后取距3年生玫瑰香葡萄主干1m范围内深度为10~40cm的土壤，最后剔除石块和葡萄根系等杂质混匀过筛备用。栽培园土基本理化性质为全氮1.4g/kg，全磷0.4g/kg，全钾16.9g/kg，速效氮41.7mg/kg，速效磷33.4mg/kg，速效钾.7mg/kg，pH值7.6。定植1个月后选择长势一致、无病虫害的优质植株进行处理。

菌肥采用现用现配的方式在天津农科院菌肥发酵车间制备完成，发酵用复合菌种(Streptomycessaraceticus31，SS31)引自台湾同安农业科技有限公司，与大豆、白砂糖等在有氧条件下发酵制备成液态SS31菌肥用于本试验的肥料处理。SS31菌肥含有机质3%~5%，pH值为3.6~4.1，密度(25°C)为1.23g/cm3，水不溶物5g/L，含氨基酸16种，游离氨基酸为-g/L，单一有效活菌数超过2.5×cfu/ml。

试验采用不同浓度SS31菌肥进行灌根处理，设置浇灌菌肥原液(T1)、菌肥10倍稀释液(T2)、菌肥50倍稀释液(T3)、菌肥倍稀释液(T4)、菌肥倍稀释液(T5)和菌肥倍稀释液(T6)6个梯度处理，试验以浇灌蒸馏水为对照(CK)。菌肥或蒸馏水每10天浇灌一次(每株浇灌0.5L)，连续浇灌4次，并于最后一次灌根后的60d取样用于各项指标检测。每个处理30株。

1.2土壤取样方法

将每个处理的30株葡萄分成3组(每组10株)，首先每10株葡萄褪去塑料营养钵、松动土团，然后去除根系、凋落物等杂质过1mm筛后充分混匀作为一个土壤样品重复，共计3次重复。按照四分法取样，一份室内自然风干研磨过筛后用于土壤基本理化性质检测，一份迅速装入无菌自封袋用低温保存箱带回实验室4°C低温保存24h内完成土壤微生物群落功能多样性分析(Biolog-ECO法)，一份装入无菌离心管液氮冷冻运输后于-80°C低温保存用于土壤细菌群落多样性分析(高通量测序)。

1.3测定指标及方法

1.3.1土壤微生物群落功能多样性测定

在标记31种营养物质的96孔Biolog-ECO板上进行微生物培养，根据微生物对不同碳底物的利用情况，采用微生物鉴定系统(GENIIIMicroStation,Biolog,USA)检测Biolog-ECO板每个孔的颜色变化来获取微生物群落结构和功能多样性方面的信息。Biolog-ECO接种方法:将10g土样加入90ml灭菌后的0.85%NaCl溶液中封口，放入摇床震荡30分钟(r/min，25°C)。吸取土壤提取液10ml加入装有90ml灭菌NaCl溶液的三角瓶中进行稀释，再从上述稀释液中吸取土壤提取液10ml加入装有90ml灭菌NaCl溶液的三角瓶中混匀。用8通道移液枪向Biolog-ECO板培养基中加入ul提取液。接种后的Biolog-ECO板进行第一次读数，记为0h，随后将Biolog-ECO板置于恒温培养箱(25°C)中培养，分别于培养后的24h、48h、72h、96h、h、h、h、h读取吸光度，并根据以下公式计算各参数变化。其中，每种营养物质的相对利用率计算参照邹春娇等方法进行。采用96h的吸光度值进行多样性特征、主成分分析、营养物质相对利用率计算。

AWCD(平均颜色变化率)AWCD=∑(Ci-R)/31。

Shannondiversity(Shannon指数)H=-∑pi(lnpi)。

Shannonevenness(Shannon均匀度指数)E=H/lnS。

Simpsondiversity(Simpson指数)D=1-∑pi2。

McIntoshdiversity(McIntosh指数)U=sqrt(∑ni2)。

上述计算公式中，Pi为第i孔的相对吸光值(Ci-R)与整个平板相对吸光值总和的比率;S为颜色变化的孔的数目;ni是第i孔的相对吸光值(Ci-R)。

1.3.2叶片叶绿素荧光参数测定

测定时间为晴天上午9:00-10:00。首先，每个处理选取相同节位叶片(从新梢基部数第5-6片叶)采用HandyPEA的暗适应叶夹对葡萄叶片进行30min暗适应。然后，采用连续激发式植物效率分析仪(HandyPEA,HansatechInstruments,UK)测定叶绿素荧光诱导动力学曲线(OJIP曲线)。试验采用μmol/(m2s)的饱和红闪光。其中，O点、K点、J点、P点分别为最小荧光值、μs荧光值、2ms荧光值和最大荧光值。最后，通过JIP-test分析直接得到如下荧光参数/p>

Fv/Fm(最大光化学效率)=φPo=TRo/ABS=(1-FO/FM)。

PIABS(光合性能指数)=RC/ABS[φPo/(1-φPo)][ψO/(1-ψO)]。

RC/Cso(单位面积有活性反应中心的数量)=φPo(Vj/MO)(ABS/CSO)。

ABS/RC(单位反应中心吸收的能量)=Mo(1/Vj)(1/φPo)。

TRo/RC(单位反应中心捕获的用于还原QA的能量)=Mo(1/Vj)。

ETo/RC(单位反应中心用于电子传递的能量)=Mo(1/Vj)ψO。

DTo/RC(单位反应中心耗散的能量)=ABS/RC-TRo/RC。

其中，Mo为相对荧光曲线的初始斜率，Vj为在j点的相对可变荧光，ψO=ETO/TRO=(1-Vj)。

1.3.3叶片形态指标测定

采用便携式激光叶面积仪(CI-,CIDBioScience,Inc.,USA)检测叶片长度、宽度、叶面积、周长和长宽比。

1.3.4叶片SPAD值测定

采用叶绿素仪(SPAD-,MinoltaCo.,Japan)检测。

1.3.5新梢长度、新梢粗度、植株生长量测定

采用直尺测量新梢长度;采用游标卡尺测量新梢基部以上0.5cm处直径作为新梢粗度;采用电子天平测定植株生长量。

1.4数据统计与分析

所得数据采用IBMSPSSStatistics22数据处理软件进行显著性分析和主成分分析，其中显著性分析采用Duncan事后多重比较法(P0.05)，应用MicrosoftExcel软件绘图。图表中数据均为平均值±标准差。

二、结果

2.1SS31菌肥对玫瑰香葡萄土壤微生物群落结构和功能多样性的影响

AWCD值(平均颜色变化率)能够在一定程度上反映微生物的代谢活性。该值越大说明微生物活性越高，反之活性越低。如图1所示，随着培养时间的增加，各处理AWCD值均呈递增的趋势。其中，0-24h之间AWCD值呈缓慢升高的趋势，说明此时微生物对营养物质利用缓慢;24h-h之间AWCD值增加迅速，说明此时营养物质被微生物大幅利用;h后AWCD值变化趋于平缓，说明此时微生物对营养物质的利用达到平稳状态。与CK相比，不同浓度SS31菌肥处理均有效提高了微生物代谢活性。其中，T2处理后AWCD值明显高于其他处理，表明T2处理明显提高了玫瑰香葡萄根域土壤微生物对营养物质的利用能力。

与CK相比，SS31菌肥处理均显著提高了玫瑰香葡萄根域土壤微生物的Shannon指数，不同程度提高了McIntosh指数，但对Shannon均匀度指数影响不大。说明添加SS31菌肥土壤微生物种群丰富度和多样性均得到提高，土壤微生物群落之间差异性较小。其中，T2处理后Simpson指数显著高于CK，说明T2处理后土壤微生物优势种群得到显著增强(表1)。

将31种营养物质分成了6类，分别是10种碳水化合物、7种羧酸、6种氨基酸、4种聚合物、2种酚酸和2种胺类。如图2所示，与CK相比，T1、T2、T4和T5处理显著提高了土壤微生物对碳水化合物的利用，T2和T3处理明显提高了土壤微生物对羧酸的利用。各处理间微生物对氨基酸、聚合物、酚酸类、胺类利用差异不大。

不同处理后微生物对31种营养物质的利用能力存在明显差异(图3)。营养物质利用率的高低反映了微生物对营养物质利用需求的增加或衰退。与CK相比，不同浓度SS31菌肥处理均提高了玫瑰香葡萄根域土壤中微生物高利用营养物质(长度4%)的数量，依次增加了4种(T1)、3种(T3)、3种(T4)、3种(T5)、3种(T6)。菌肥处理后在一定程度上增强了玫瑰香葡萄根域土壤微生物对β-甲基-D-葡萄糖苷、D-木糖、D-甘露醇、N-乙酰-D-葡萄糖胺、D-葡萄糖胺酸的代谢活性。各处理土壤微生物对L-精氨酸、L-天冬酰胺酸、D-半乳糖醛酸、γ-羟丁酸、吐温40的代谢活性均较高(长度4%)，对α-D-乳糖、D,L-α-磷酸甘油、L-苯基丙氨酸、L-苏氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸、α-丁酮酸、肝糖、2-羟基苯甲酸的代谢活性均较低(长度2%)。

由图4可知，利用降维的方法进行主成分分析后发现31个主成分因子中第一主成分(PC1)方差贡献率为17.6%，第二主成分(PC2)方差贡献率为14.1%，其他主成分方差贡献率较小。因此，本试验中选取累积方差贡献率为31.7%的前两个主成分PC1和PC2来进行微生物群落功能多样性分析。

将PC1、PC2得分系数与单一营养物质吸光度进行相关性分析得出31种营养物质在PC1、PC2上的载荷值。从表2可以看出，与PC1显著相关的营养物质共有13种，分别属于碳水化合物3种、氨基酸4种、胺类1种，说明有13种营养物质使不同处理间土壤微生物群落代谢功能多样性在PC1上差异显著，决定PC1的分异。与PC2显著相关的营养物质共有5种，分别属于羧酸1种、氨基酸2种、酚酸类1种、胺类1种，说明有5种营养物质使不同处理间土壤微生物群落代谢功能多样性在PC2上差异显著，决定PC2的分异。

根据各处理后土壤微生物在PC1和PC2上分布可以看出，不同处理土壤微生物群落间存在明显分异，即各处理显著影响了玫瑰香葡萄根域土壤微生物群落的代谢特征(图5)。T1、T2、T4、T5处理后投射点位于PC1的最右端，说明这4个浓度菌肥处理后土壤微生物群落代谢活性较高。且T2处理投射点位于PC2的最上端，即T2处理明显诱导了土壤微生物群落代谢活性的增强。相反，CK投射点位于PC1的最左端，说明CK土壤微生物群落代谢活性明显低于其他处理。

2.2SS31菌肥对玫瑰香葡萄叶片发育及叶绿素含量的影响

如表3所示，与CK相比，T2和T5处理后玫瑰香葡萄叶面积、叶片长度和宽度有所提高，但差异不明显。其中，T5处理还显著提高了叶片周长。T1处理叶面积、叶片长度、宽度、周长最小。各处理后叶片长宽比为1.03-1.07，差异不显著。与CK相比，T1、T2、T3处理均显著提高了叶片叶绿素含量(图6)。其中，T1处理效果最为显著，其叶绿素含量是对照的2.3倍，其次为T2处理，但T1(高浓度菌肥)处理后玫瑰香葡萄试材有一部分出现了烧苗现象，另一部分试材则受高浓度菌肥的刺激反而萌发大量白色新根，增强了根系对土壤养分和水分的吸收能力。植物地下部与地上部存在物质与能量交换、相互促进的协调关系，根系的良好发育将促进地上部枝叶的生长，这也许就是导致T1处理后叶绿素含量显著增加的一个原因，但有待于进一步研究。

2.3SS31菌肥对玫瑰香葡萄叶片叶绿素荧光参数的影响

如图7所示，与CK相比，T1、T2、T3、T4均显著提高了玫瑰香葡萄叶片最大光化学效率(Fv/Fm)，其中T1处理效果最为显著，其次为T2处理。各菌肥处理均在一定程度上提高了玫瑰香葡萄叶片光合性能指数(PIABS)，其中仅有T1和T2处理达到显著水平。与CK相比，T1、T2处理显著提高了玫瑰香葡萄叶片单位面积有活性反应中心的数量(RC/CSo)，降低了叶片单位反应中心吸收的能量(ABS/RC)、单位反应中心捕获的用于还原QA的能量(TRo/RC)、单位反应中心耗散的能量(DIo/RC)，但明显提高了叶片单位反应中心用于电子传递的能量(ETo/RC)。综上，T1和T2处理后虽然吸收和捕获的能量明显降低，但二者通过增加单位面积反应中心的数量和光合电子传递的能量，同时降低耗散的能量，明显诱导了叶片光能利用率的增强。

2.4SS31菌肥对玫瑰香葡萄植株生长量的影响

与CK相比，T2和T5处理显著提高了玫瑰香葡萄新梢长度、叶片数、节间数和地上部鲜重(表4，图8)。各菌肥处理对新梢粗度影响不大。其中，T5处理还显著提高了玫瑰香葡萄地下部鲜重，T6处理地下部鲜重最低。T1处理后葡萄地上部鲜重显著低于其他各处理。

三、讨论

3.1SS31菌肥对葡萄根域土壤微生物代谢特征的影响

土壤微生物及其参与的生物化学过程能够影响土壤有机质和养分的循环、土壤结构组成，在维持生态系统平衡中发挥着不可替代的作用。其中，微生物多样性及其群落结构是判定土壤肥力及健康状况的重要指标。利用Biolog-ECO板接种法检测土壤微生物群落利用单一营养物质能力已经成为研究土壤微生物群落功能多样性的一项重要方法。根据96孔Biolog-ECO板接种后各孔吸光度的变化可以计算AWCD(平均吸光度、平均颜色变化率)、土壤微生物多样性指数、土壤微生物对六类营养物质的利用能力等指标。其中，AWCD能够反映土壤微生物群落的营养物质利用率，该值大小与微生物密度和代谢活性正相关。已有研究指出，外源肥料的输入打破了土壤原有生态平衡，因此会影响土壤微生物群落结构和功能。本研究中发现，不同浓度SS31菌肥处理均显著提高了土壤AWCD值，即显著提高了土壤微生物的代谢活性，而微生物的代谢活动可以增加土壤中速效氮磷钾的含量，将有利于改善土壤微环境。此外，土壤中多余的碳可能已被菌肥中的微生物利用，从而使土壤微生物群落代谢活性最大化。其中，T2处理效果最显著。该菌肥使用后效果与Mishra等、李依韦等使用生物菌肥提高作物根际土壤微生物AWCD的研究结果相似。

土壤微生物营养物质利用情況可以由Shannon指数、Shanmon均匀度指数、Simpson指数、Mclntosh指数等土壤微生物功能多样性指数来反映。其中，Shannon指数反映了可供士壤微生物利用的营养物质种类的多少，评估丰富度和均度，该值越大，说明物种丰富度越高。Shannon均匀度指数是基于Shannon指数计算出的土壤微生物群落均度，该指数越高表明微生物群落差异性越大。Simpson指数反映了微生物群落中常见物种的优势度大小，该值越大，说明在微生物群落中优势种的地位越突出。Melntosh指数是基于群落物种多维空间上的Euclidian距离的多样性指数，评估土壤微生物群落的多样性。施用菌肥或接种菌剂可显著提高土壤微生物群落多样性。Kumar等研究发现，在鹰嘴豆上单独或联合应用Pseudomonasputida和Bacillusamyloliquefaciens菌株均能有效提高士壤微生物的Shannon指数、Shannon均匀度指数、Simpson指数和Mclntosh指数。本研究与上述研究结果相似，与对照相比不同浓度SS31菌肥处理不同程度提高了葡萄根域土壤微生物群落的多样性。其中，工处理显著增强了土壤微生物群落丰富度、优势种群的地位和多样性。结合主成分分析结果可以看出，菌肥处理明显改变了玫瑰香葡萄根域土壤原有微生物的群落结构及功能多样性。通过分析菌肥处理后土壤微生物对六类营养物质的利用情况和对单一营养物质的利用率发现，菌肥使用后不同程度上促讲了士壤微生物对碳水化合物、羧酸、氨基酸和胺类的利用，且土壤微生物对单一营养物质β-甲基-D-葡萄糖苷、D-大糖、D-甘露醇、N-乙酰-D-葡萄糖胺、D-葡萄糖胺酸的代谢活性有所提高。其中，T2处理明显诱导土壤微生物群落代谢活性的提高，主要促进了士壤微生物对碳水化合物(β-甲基-D-葡萄糖苷、D-苹果酸、D-木糖、i-赤藓糖醇、N-乙酰-D-葡萄糖胺、）和羧酸（D-葡萄糖胺酸、D-苹果酸）的利用。

3.2SS31菌肥对葡萄叶片光合性能的影响

StrasserandStrasser基于生物膜能量流动模型建立了快速叶绿素荧光诱导动力学曲线数据分析及处理方法(JIP-test)，使采用叶绿素荧光探针技术研究光合机构“内在性”特点(如PSII对光能的吸收、捕获、传递和耗散等)的方法得到广泛应用。叶绿素荧光参数在一定程度上可反映植物光合系统结构和功能对环境变化的响应特征。其中，PSII最大光化学效率(Fv/Fm)既能反映PSII受体侧(QA、QB和PQ库等)的变化，又可表征植物的光抑制程度。基于光能吸收为基础的光合性能指数(PIABS)由RC/ABS、φP0/(1-φP0)和ψ0/(1-ψ0)3个参数计算得来，较Fv/Fm对环境因子的变化更为敏锐。有研究指出，适宜浓度的微生物菌剂能够有效提高植物叶片光能利用潜力。本研究中也发现，T1和T2处理显著提高了玫瑰香葡萄叶片Fv/Fm和PIABS，即明显诱导了PSII原初光能转换效率的增强，提升了玫瑰香葡萄叶片光能利用潜力。该结果与Babaei等和Eisvand等在小麦上应用微生物肥料后的效果一致。

当植物暴露在光下，其聚光色素(天线色素)吸收的能量一部分被PSII的反应中心捕获随后用于光合电子传递，另一部分则以荧光和热能的形式耗散掉(图9)。为了准确研究植物吸收的光能去向及利用率，可通过分析RC/Cso，ABS/RC、TRo/RC、ETo/RC、DIo/RC等叶绿素荧光参数来判断。本研究中，T2处理显著提高了RC/Cso，明显降低了ABS/RC，暗示T2处理后有活性反应中心数量的增加程度远高于天线色素对能量的吸收程度。TRo/RC是单位反应中心捕获的能量流。因此，T2处理后ABS/RC的下降导致了单位反应中心捕获的用于还原QA的能量(TRo/RC)的降低，但此时电子传递链QA-后的电子传递并未受到抑制，T2处理反而显著提高了单位反应中心用于电子传递的能量(ETo/RC)。光合电子传递与能量的耗散(热能和荧光)之间存在竞争关系，任一改变都将牵动其他两者的变化。本研究的确发现，T2处理增强了光合电子传递的同时降低了能量的耗散(DIo/RC)。综合以上结果我们初步分析，在光能的吸收、捕获受到抑制的时候，单位面积有活性反映中心数量迅速增加，在保证电子传递的同时有效降低了能量耗散，进而产生了Fv/Fm和PIABS增加的结果。

叶片叶绿素含量是评价植物光合作用速率的重要生理指标，且叶片SPAD值与叶绿素含量显著相关。因此，可以通过测定叶片SPAD值这种无损检测手段来预测植物叶绿素含量。本试验中，T1、T2和T3处理显著提高了玫瑰香葡萄叶片SPAD值，该结果与Pogrzeba等、Zai等菌液应用效果相似，可能与微生物菌剂的应用提高了叶片对Mg和P的吸收有关。

四、结论

适宜浓度的SS31菌肥能够有效提高玫瑰香葡萄根域土壤微生物的代谢活性和多样性。其中，T2处理(菌肥稀释10倍)后应用效果最好，能够显著增强玫瑰香葡萄根域土壤微生物群落丰富度、优势种群的地位和多样性，提高土壤微生物对碳水化合物和羧酸的利用，并通过增强单位面积有活性反应中心的数量(RC/Cso)和单位反应中心用于电子传递的能量(ETo/RC)，降低用于耗散的能量(DIo/RC)，明显诱导玫瑰香葡萄光能利用潜力的增强。

转自《吉林农业大学学报》侵删